Das Kolosseum erfuhr im Mittelalter bedeutende Veränderungen in seiner Nutzung. Im späten 6. Jahrhundert wurde im Inneren des Amphitheaters eine bescheidene Kirche errichtet, obwohl dieser Anbau dem Gebäude als Ganzes keinen religiösen Sinn zu geben scheint. Die Arena wurde in der Zwischenzeit in einen Friedhof umgewandelt, und die weiten Räume zwischen den Bögen und unter den Sitzen wurden als Werkstätten und Unterstände genutzt. Historischen Aufzeichnungen zufolge wurden diese Räume sogar bis ins 12. Jahrhundert hinein verpachtet.

Unter dem Pontifikat Gregors des Großen wurden zahlreiche antike Monumente unter die Obhut der Kirche gestellt, die damals die vorherrschende Autorität war. Aufgrund mangelnder Ressourcen war die Kirche jedoch nicht in der Lage, die Denkmäler ordnungsgemäß instand zu halten, so dass sie nicht mehr genutzt und geplündert wurden. Im Mittelalter wirkte sich der Niedergang der Stadt auf alle Überreste des Römischen Reiches aus. Erdbeben in den Jahren 801 und 847 fügten einem praktisch verlassenen Gebäude am Rande der mittelalterlichen Stadt schwere Schäden zu.

Als Papst Gregor VII. 1084 aus Rom verbannt wurde, gingen mehrere Monumente in die Hände der einflussreichen Adelsfamilien der Stadt über, die sie als Befestigungsanlagen nutzten. Um 1200 nahm die Familie Frangipani das Kolosseum in Besitz und befestigte es, wobei sie es wie eine Burg behandelte und ihre Herrschaft darüber begründete. Das Kolosseum wechselte mehrmals den Besitzer, bis es 1312 an die Kirche zurückgegeben wurde.

Das verheerende Erdbeben von 1349 fügte der Struktur des Kolosseums erhebliche Schäden zu und führte zum Einsturz der Südseite der Außenfassade. Viele der gelösten Steine wurden geborgen und für den Bau von Palästen, Kirchen (einschließlich der Gebäude in der Vatikanstadt), Krankenhäusern und anderen Gebäuden in ganz Rom verwendet. Ein religiöser Orden ließ sich im nördlichen Teil des Kolosseums nieder und lebte dort bis ins frühe 19. Der Stein im Inneren des Amphitheaters wurde in großem Umfang abgebaut, entweder zur Wiederverwendung an anderer Stelle oder, wie im Fall der Marmorfassaden, zur Herstellung von Branntkalk durch Brennen. Die Bronzeträger, die das Mauerwerk an seinem Platz hielten, wurden von den Wänden entfernt und hinterließen zahlreiche Spuren. Diese Narben sind noch heute in der Struktur des Gebäudes zu sehen.