Das Kolosseum wurde auf vielfältige Weise genutzt, unter anderem für die berühmten Gladiatorenkämpfe und eine Vielzahl spektakulärer Veranstaltungen. Diese als munera bezeichneten Spektakel wurden in der Regel von den Bürgern und nicht vom Staat finanziert. Obwohl sie eine starke religiöse Komponente hatten, dienten sie auch der Macht- und Prestigesicherung der Sponsorenfamilien und erfreuten sich bei der einfachen Bevölkerung großer Beliebtheit. Ein weiteres wichtiges Ereignis waren die Tierjagden, die so genannten venatio, bei denen eine Vielzahl wilder Tiere, viele von ihnen aus Afrika importiert, wie Nashörner, Flusspferde, Elefanten, Giraffen, Löwen, Panther, Leoparden, Krokodile und Strauße, gejagt wurden. Diese Kämpfe und Jagden fanden in Arenen mit Bäumen und beweglichen Strukturen statt.

Manchmal wurden diese Veranstaltungen in großem Stil abgehalten; Trajan soll seine Siege in Dakien im Jahr 107 mit Spielen gefeiert haben, an denen 11.000 Tiere und 10.000 Gladiatoren beteiligt waren und die 123 Tage dauerten. Das Publikum oder der Kaiser hatten die Befugnis, über das Schicksal eines verwundeten Gladiators zu entscheiden, indem sie den Daumen hoch oder runter zeigten, was das Leben oder den Tod des besiegten Kämpfers bedeutete.

In den Anfängen des Kolosseums erwähnten antike Schriftsteller, dass das Gebäude für Naumachien, d. h. für simulierte Seeschlachten, genutzt wurde. In Berichten über die von Titus im Jahr 80 n. Chr. veranstalteten Eröffnungsspiele wird beschrieben, dass die untere Ebene geflutet wurde, um Pferde und Stiere vorzuführen, die zuvor im Schwimmen trainiert worden waren. Es wird auch von der Nachstellung einer berühmten Seeschlacht zwischen den Korfu-Griechen und den Korinthern berichtet. Dies hat jedoch unter Historikern Diskussionen ausgelöst, da nicht klar ist, wie die Arena wasserdicht gemacht werden sollte oder ob genügend Platz für die Bewegung von Kriegsschiffen vorhanden war. Einige vermuten, dass sich diese Hinweise auf einen anderen Ort beziehen oder dass das Kolosseum ursprünglich einen überflutbaren Kanal entlang seiner Mittelachse hatte, bevor es durch das Hypogäum ersetzt wurde.

Auch der Dichter Martial nahm Bezug auf diese Eröffnungsspiele, insbesondere auf einen epischen Gladiatorenkampf zwischen Vero und Priscus. Die beiden Kämpfer traten vor Kaiser Titus gegeneinander an, und trotz ihres anstrengenden Kampfes gelang es keinem von ihnen, den anderen zu besiegen. Dieses ungewöhnliche Unentschieden wurde von der Menge bejubelt und veranlasste den Kaiser, die beiden am Leben zu lassen. Dieses außergewöhnliche Ereignis wurde in Martials Werk Liber spectaculorum festgehalten.

Neben Kämpfen und Jagden wurden in der Arena auch Darstellungen von Naturlandschaften aufgeführt, so genannte Sylvae. Maler, Techniker und Architekten schufen Simulationen von Wäldern mit echten Bäumen und Sträuchern, die auf dem Boden der Arena gepflanzt wurden. Tiere wurden eingeführt, um diese Landschaften zu bevölkern und das Publikum zu verblüffen. Diese Kulissen dienten manchmal einfach dazu, der Stadtbevölkerung natürliche Umgebungen zu zeigen, oder als Kulisse für Jagdszenen und Darstellungen mythologischer Episoden. Gelegentlich wurden sie für Hinrichtungen genutzt, bei denen der Verurteilte die Rolle des Helden der Geschichte spielte und auf grausame, aber mythologische Weise hingerichtet wurde, indem er entweder von Bestien verschlungen oder verbrannt wurde.