Le Colisée avait des fonctions très diverses, notamment les célèbres combats de gladiateurs et toute une série d'événements spectaculaires. Ces spectacles, connus sous le nom de munera, étaient généralement financés par les citoyens plutôt que par l'État. Bien qu'ils aient une forte composante religieuse, ils servaient également de démonstration de pouvoir et de prestige pour les familles qui les finançaient, et devenaient extrêmement populaires auprès de la population. Un autre événement important était la chasse aux animaux, connue sous le nom de venatio, qui mettait en scène une grande diversité de bêtes sauvages, souvent importées d'Afrique, comme les rhinocéros, les hippopotames, les éléphants, les girafes, les lions, les panthères, les léopards, les crocodiles et les autruches. Ces combats et ces chasses se déroulaient dans des arènes avec des arbres et des structures mobiles.

Parfois, ces événements prenaient une ampleur grandiose : Trajan aurait commémoré ses victoires en Dacie en 107 par des jeux impliquant 11 000 animaux et 10 000 gladiateurs, qui auraient duré 123 jours. Le public ou l'empereur avait le pouvoir de décider du sort d'un gladiateur blessé en levant ou en baissant le pouce, ce qui représentait la vie ou la mort du combattant vaincu.

Durant les premiers temps du Colisée, les auteurs antiques ont mentionné que le bâtiment était utilisé pour organiser des naumachies, ou simulacres de batailles navales. Les comptes rendus des jeux inauguraux organisés par Titus en 80 après J.-C. décrivent l'inondation du niveau inférieur pour présenter des chevaux et des taureaux qui avaient été entraînés à la nage. Il est également fait mention d'une reconstitution d'une célèbre bataille navale entre les Grecs de Corfou et les Corinthiens. Cette mention a toutefois suscité un débat parmi les historiens, car on ne sait pas exactement comment l'arène aurait été imperméabilisée ni s'il y aurait eu suffisamment d'espace pour le déplacement des navires de guerre. Certains suggèrent que ces références se rapportent à un autre site ou que le Colisée disposait à l'origine d'un canal inondable le long de son axe central avant d'être remplacé par l'hypogée.

Le poète Martial a également fait référence à ces jeux inauguraux, en particulier à un combat de gladiateurs épique entre Vero et Priscus. Les deux combattants s'affrontèrent devant l'empereur Titus et, malgré leur combat acharné, aucun ne parvint à vaincre l'autre. Ce match nul inhabituel est acclamé par la foule et conduit l'empereur à leur épargner la vie. Cet événement exceptionnel est relaté dans l'ouvrage Liber spectaculorum de Martial.

Outre les combats et les chasses, des représentations de paysages naturels, appelées sylvae, étaient jouées dans l'arène. Peintres, techniciens et architectes créaient des simulations de forêts avec de vrais arbres et arbustes plantés sur le sol de l'arène. Des animaux étaient introduits pour peupler ces paysages et émerveiller le public. Ces décors étaient parfois utilisés simplement pour montrer des environnements naturels à la population urbaine, ou comme toile de fond pour des scènes de chasse et des représentations d'épisodes mythologiques. Parfois, ils étaient utilisés pour des exécutions dans lesquelles le condamné jouait le rôle du héros de l'histoire et était exécuté d'une manière macabre mais mythologique, soit en étant dévoré par des bêtes, soit en étant brûlé à mort.