L'intérieur de San Isidoro surprend le visiteur par sa grande luminosité, due à l'abondance de larges baies vitrées dans la nef centrale et dans le transept sud. Les parements, tant droits que courbes, sont décorés d'imposte en damier, un motif qui se répète de manière uniforme dans tout l'espace, tandis que les chapiteaux se distinguent par leur richesse et leur nombre, offrant un répertoire sculptural varié et détaillé.

La chapelle principale, construite au XVIe siècle et attribuée à Juan de Badajoz el Viejo, a été commandée par le père Juan de Cusanza en 1513 pour remplacer l'ancienne chapelle romane de l'infante Urraca. En 1971, des travaux de nettoyage et de restauration du sol ont été réalisés, permettant de remettre à nu les fondations de la structure romane découvertes par l'architecte Torbado, signalées par un dessin sur le pavement. La chapelle est couverte d'une voûte d'ogives à tercelets, reflet de la transition entre le gothique tardif et les goûts de la Renaissance de l'époque.

Le retable principal, de facture gothique, provient de la paroisse de Pozuelo de la Orden (Valladolid) et a été transféré à San Isidoro en 1920. Réalisé entre 1525 et 1530, il a bénéficié de la participation d’un maître appelé Giralte, peut-être Giralte de Bruxelles, et se compose de vingt-quatre panneaux peints attribués par Chandler R. Post à un Maître de Pozuelo, identifié par la suite comme étant Lorenzo de Ávila, disciple de Juan de Borgoña, ainsi qu’à Antonio Vázquez et Andrés de Melgar, liés au cercle d’Alonso Berruguete. L'ostensoir, œuvre en argent de M. García Crespo, conserve l'hostie consacrée exposée jour et nuit par privilège papal, partagé avec la cathédrale de Lugo, et sous celui-ci se trouve l'urne néoclassique contenant les restes de saint Isidore, réalisée en 1847 par l'orfèvre de León Antonio Rebollo.

La chapelle de la Trinité, ou de Santo Martino, a été construite vers 1191 par le chanoine isidorien Santo Martino derrière l’abside nord, afin de conserver des reliques et de servir de cimetière commun aux chanoines. À l'origine petite, de plan rectangulaire et dotée d'un chevet semi-circulaire, et érigée avec des matériaux modestes, elle fut transformée au XVIe siècle dans le style hispano-flamand et prit le nom de chapelle de Santo Martino. Le retable, datant du XVIIe siècle et œuvre du traceur et assembleur Pedro Margotedo, abrite l'image du saint patron et l'urne contenant les restes du saint.

Le chœur haut, situé au pied de l'église, date de la première moitié du XVe siècle et est de style gothique. Il a été construit sous l'abbatiat de Simón Álvarez, dont les armoiries sont visibles sur l'une des clés de voûte, s'intégrant ainsi à la décoration riche et variée de l'édifice.