La chapelle de San Ambrosio est la première des chapelles rattachées au mur occidental. Il s'agit de l'une des plus anciennes chapelles du bâtiment. Son plafond est en bois et il ne reste que quelques vestiges du plafond à caissons d'origine.

Il n'est pas possible de déterminer le nom de la personne qui a fondé la chapelle, qui a été rénovée par le maître d'œuvre Juan Ruíz de Córdoba en 1528. En 1839, elle a été restaurée par Pedro María Villavicencio, qui était également maître de la cathédrale. La persistance de la dignité cathédrale des maestrescuelas liée à cette chapelle est due au fait que la clôture et la dédicace à Saint Ambroise étaient liées au patronage de la maestrescolía.

Le retable, commandé aux frères Sánchez de Rueda en 1717, se compose d'un banc, d'un corps et d'un attique semi-circulaire. Le banc, au moyen de quatre bases, sert de support aux supports du corps principal. Elle est articulée à partir de colonnes solomoniques, et est décorée de peintures de l'Ascension et de l'Épiphanie, de qualité médiocre, exécutées par Pedro Ruiz Morián, et son exécution ayant été arrangée en 1723. La rue centrale du retable, qui est deux fois plus large que les rues latérales, est occupée par une image de Saint Ambroise du 17ème siècle. Dans l'attique du retable se trouve un calvaire sculpté de la fin du XVIe siècle.