Durante los siglos XVI y XVII, la Universidad de Alcalá se consolidó como uno de los centros académicos más prestigiosos del mundo hispánico. Se convirtió en un foco de saber y pensamiento crítico, especialmente en los ámbitos de la teología, la filosofía, el derecho, las lenguas clásicas y la medicina. Su imprenta, la famosa Typographia Complutense, fue célebre por la edición de la Biblia Políglota Complutense, una obra monumental coordinada por el propio Cisneros.
En 1777, en el marco de las reformas ilustradas del reinado de Carlos III, la universidad fue separada institucionalmente de su emblemático Colegio Mayor y pasó a denominarse Real Universidad de Alcalá. Esta nueva etapa la ubicó en el edificio que antes ocupaba el Colegio Máximo de los Jesuitas, también en Alcalá. Sin embargo, la institución entró en un lento declive debido a los cambios políticos, sociales y económicos que afectaron a la España de finales del siglo XVIII y principios del XIX.
Finalmente, en 1836, la universidad fue trasladada a Madrid, en un proceso de centralización del sistema educativo promovido por el Estado liberal. Se fusionó con los Reales Estudios de San Isidro y el Real Museo de Ciencias Naturales para conformar la Universidad Central de Madrid, germen de la actual Universidad Complutense de Madrid, heredera directa de la tradición cisneriana.
A lo largo de su historia, la Universidad de Alcalá fue cuna y hogar de numerosas figuras clave del pensamiento, la literatura y la ciencia. Entre sus profesores y alumnos más célebres destacan Antonio de Nebrija, autor de la primera gramática de la lengua castellana; Santo Tomás de Villanueva; el historiador Juan Ginés de Sepúlveda; San Ignacio de Loyola, fundador de la Compañía de Jesús; el teólogo Domingo de Soto; el cronista Ambrosio de Morales; Benito Arias Montano, editor de la Biblia Regia; el filósofo jesuita Francisco Suárez; el jesuita e historiador Juan de Mariana; el médico Francisco Vallés de Covarrubias; el político Antonio Pérez; místicos como San Juan de la Cruz; escritores de la talla de Mateo Alemán, Lope de Vega, Francisco de Quevedo y Pedro Calderón de la Barca; el ilustrado Melchor Gaspar de Jovellanos; el científico Andrés Manuel del Río, descubridor del vanadio; y el religioso Fray Diego Morcillo, entre muchos otros.