Todo el tercio sur de la estructura, está ocupado por el monasterio. Aunque los Padres Agustinos de clausura viven en él desde 1885, los monjes jerónimos lo habitaron por primera vez en 1567. Una de las representaciones más destacadas de la arquitectura del Monasterio, el Patio de los Evangelistas, obra maestra de Juan Bautista de Toledo, sirve de punto focal del recinto. La magnífica escalera principal que comunica sus dos plantas cuenta con frescos de Luca Giordano en sus bóvedas. Luca Cambiaso y Pellegrino Tibaldi continuaron el ambicioso concepto gráfico de Luca Cambiaso para sus columnatas. Juan de Herrera, que se inspiró en el Tempietto de San Pietro in Montorio de Bramante, creó un impresionante templo en el centro del claustro con granito, mármol y jaspe de diversos colores. Juan Bautista Monegro cinceló las esculturas de los cuatro Evangelistas a partir de un único bloque de mármol, y cada uno de ellos sostiene un libro abierto con un pasaje de su Evangelio impreso en la lengua en que fue escrito originalmente.

La Celda Inferior del Priorato, distinta de las Salas Capitulares contiguas, presenta en el techo una pintura de El Juicio de Salomón, de Francesco da Urbino, que sirve de recordatorio al prior de la necesidad de tener una administración justa al frente del Monasterio. En la sacristía, todavía en uso, se encuentra La Adoración de la Sagrada Forma, de Claudio Coello. El Martirio de San Lorenzo de Tiziano, una de las grandes obras del Renacimiento italiano, se conserva en la Iglesia Vieja o Prestada. Felipe II lo mandó pintar para el retablo mayor de la Basílica, pero decidió no hacerlo por su colorido oscuro, que dificultaba su visión desde lejos.