El Coliseo atravesó transformaciones significativas en su uso durante la era medieval. A finales del siglo VI, se erigió una modesta iglesia en el interior de la estructura del anfiteatro, aunque no parece que esta incorporación haya conferido un sentido religioso a la totalidad del edificio. La arena, por su parte, fue convertida en un camposanto, y los amplios espacios entre los arcos y debajo de los asientos encontraron nuevos propósitos como talleres y refugios. Según los registros históricos, estos espacios incluso se arrendaron hasta el siglo XII.
Durante el pontificado de Gregorio Magno, numerosos monumentos antiguos pasaron bajo la tutela de la Iglesia, que entonces ostentaba la autoridad predominante. Sin embargo, debido a la falta de recursos, la Iglesia no pudo mantenerlos adecuadamente, y, como resultado, estos monumentos cayeron en desuso y fueron objeto de saqueos. En la Edad Media, la decadencia de la ciudad afectó a todos los vestigios del imperio romano. Los terremotos ocurridos en los años 801 y 847 infligieron severos daños a un edificio prácticamente abandonado en los confines de la ciudad medieval.
En 1084, cuando el papa Gregorio VII fue desterrado de Roma, varios monumentos pasaron a manos de las influyentes familias nobles de la ciudad, quienes los utilizaron como fortificaciones. Alrededor del año 1200, la familia Frangipani se adueñó del Coliseo y lo fortificó, tratándolo como un castillo y estableciendo su dominio sobre él. El Coliseo cambió de propietarios en varias ocasiones hasta su devolución a la Iglesia en 1312.
El devastador terremoto de 1349 infligió daños sustanciales a la estructura del Coliseo, resultando en el colapso del lado sur de su fachada externa. Muchas de las piedras desprendidas se recuperaron y se utilizaron en la construcción de palacios, iglesias (incluidos edificios en la Ciudad del Vaticano), hospitales y otras edificaciones en toda Roma. Una orden religiosa se estableció en la porción norte del Coliseo y habitó en ella hasta principios del siglo XIX. La piedra del interior del anfiteatro sufrió una intensa extracción, ya sea para su reutilización en otros lugares o, en el caso de las fachadas de mármol, para la producción de cal viva mediante la quema. Las abrazaderas de bronce que sostenían la mampostería fueron retiradas de las paredes, dejando detrás de sí numerosas marcas. Estas cicatrices aún se pueden apreciar en la estructura del edificio en la actualidad.