El Museo Sefardí ocupa el antiguo Convento de Caballeros de Calatrava, anexo a la Sinagoga del Tránsito, y muestra aspectos históricos, religiosos y de las costumbres del pasado judío en España, así como de los sefardíes, los descendientes de los judíos que vivieron en la península ibérica hasta 1492.

En el año 1964,​ se decide que la sinagoga del Tránsito o sinagoga de Samuel ha-Leví sea la sede del museo sefardí, el cual tiene como objetivo conservar el legado de la cultura hispano-judía y sefardí para que quede integrada como parte esencial del Patrimonio Histórico Español, tarea que desempeña hasta la actualidad. Conforme a lo dispuesto en el Real Decreto 1305/2009, de 31 de julio, por el que se crea la Red de Museos de España, el Museo Sefardí es uno de los Museos Nacionales de titularidad y gestión estatal, adscrito al Ministerio de Cultura.

Es un Museo Nacional de España adscrito al Ministerio de Educación, Cultura y Deporte, es de gestión exclusiva de la Dirección General de Bellas Artes y Patrimonio Cultural.

La primera sala muestra la historia, geografía y cultura del pueblo judío en el Próximo Oriente Antiguo, donde según los escritos bíblicos se originaron las tradiciones que perduran en su vida cotidiana. Se muestran objetos arqueológicos fechados entre el 2000 a.C. y el siglo I d.C. así como una gran variedad de objetos culturales relacionados con lo que es y lo que significa ser judío, sus creencias y costumbres. Destaca una Torah (libro sagrado del judaísmo, formado por el Pentateuco) y otros objetos litúrgicos.