La extraordinaria colección de pinturas que alberga el Monasterio, fue reorganizada en la segunda mitad del siglo XX para la correcta instalación de la colección, ya que las obras habían estado mal expuestas desde la antigüedad en las Salas Capitulares y en la Sacristía, donde la limitada e inapropiada iluminación y la falta de espacio no sólo dificultaban la contemplación de las pinturas, sino que mermaban su magnífica calidad de colores, luz y composición.

En este sentido, el objetivo principal era dar a la conmemoración del cuarto siglo de construcción del Monasterio la máxima significación y eficacia. Uno de los proyectos de restauración más notables fue el realizado en el Palacio de Verano de Felipe II, que se encontraba en un estado de deterioro total, sin carpintería, sin soldados y con el enlucido dañado. En estas estancias, que se encuentran en la planta baja, a la altura del Jardn de los Frailes, se han instalado pinturas de las escuelas flamenca, alemana, italiana y espaola, que incluyen todas las salas y aposentos con sus salones, que coinciden exactamente con los de la planta superior o Palacio de Felipe II y que rodean el Patio de los Mascarones. Cuando se eliminaron todos los añadidos y se reconstruyó la estructura original, las salas, salones principales y salones de recepción que se añadieron a este conjunto en tiempos del fundador volvieron a verse tal y como fueron concebidos, con unas dimensiones y un aspecto similares a las Salas Capitulares, pero divididas en altura y abundantemente tabicadas en tiempos de Carlos IV. Diez salas en total han dado acceso a Madrid a una nueva e importante muestra de arte internacional.

Las escuelas alemana y flamenca, produjeron pinturas en los siglos XV y XVI en la Sala I. Entre las piezas más significativas de esta exposición se encuentran el Paisaje con San Cristóbal de Patinir, Las marionetas impropias (Ecce Homo) del Bosco, una parte de La Creación, una recreación de El jardín de las delicias, los Estudios de historia natural de Durero y un Tríptico de Gerard David con La Piedad (centro), San Juan Bautista (izquierda) y San Francisco recibiendo los estigmas (derecha). Junto con Las tentaciones de San Antonio, de la escuela del Bosco, El cambista y su mujer, de Marinus Reymerswaele, Descanso en la huida a Egipto, atribuido a Quentin Massys, y un considerable paño gótico del Calvario pintado en lugar de bordado en el siglo XV con la técnica del "trepas o repostero" son otras obras de arte notables.

Michel Coxcie, artista flamenco, creó el Tríptico de San Felipe, la Anunciación, la Virgen y el Niño con San José y Santa Ana, la Virgen y San José postrados ante el Niño Jesús, la Ofrenda al Niño Jesús y la Santa Cena de la Sala II.

El Entierro de Cristo, Cristo crucificado, cuya sangre redentora es recogida por tres ángeles, Cristo mostrado al pueblo por Pilatos (Ecce Homo), La Oración en el Huerto y San Jerónimo en oración son algunas de las valiosas obras de Tiziano que se encuentran en la Sala III. También se exponen La Adoración de los Reyes y El descanso durante la huida a Egipto, de Francesco Bassano, así como Noli me tángere, réplica del Veronés de Luca Giordano.

En la amplia Sala IV, que corresponde a la Sala del Trono de la planta baja, se exponen, entre otras, obras de Tiziano (La Última Cena y San Juan Bautista), así como un magnífico lienzo del pintor francés Francesco Bassano. Juan Bautista), una soberbia serie de Tintoretto (La Magdalena ungiendo los pies del Señor en casa del fariseo; Magdalena penitente; El entierro de Cristo; Desmayo de la reina Esther ante Asuero y Nacimiento con la Adoración del Pastor (Adoración de los Reyes y Adoración de los Pastores).

Tres obras de José de Ribera, entre ellas San Jerónimo penitente, San Antonio, José pastoreando el ganado de Labán, San Francisco, El entierro de Cristo, El rey ermitaño, San Pablo, El filósofo Crisipo, San Juan Bautista niño y Esopo, figuran en la sala V, dedicada a sus obras.

Diferentes modelos de cerámica de Talavera, realizados para las necesidades del Monasterio, se exponen entre las salas V y VI en un armario diáfano a ambos lados con puertas de cristal. Estos modelos incluyen tinteros, jarras, platos, cuencos, fuentes, fuentes, eslingas, jofainas, azulejos para zócalos y estantes, y azulejos para superficies en ángulo.

La Túnica de José de Velázquez, pintada durante la estancia del artista sevillano en Roma en 1630 (al igual que La fragua de Vulcano) destaca entre las obras de la escuela española del siglo XVII en la Sala VI, que corresponde a los aposentos de Felipe II en el nivel superior. Otras obras destacadas son Presentación de la Virgen en el Templo de Zurbarán, Nacimiento de la Virgen de Valdés Leal, Virgen con el Niño de Alonso Cano, Vista del Palacio de Aceca de Juan Bautista del Mazo, y un Retrato de Carlos II niño de Carreo de Miranda.

El profeta Isaías y la sibila de Eritrea, de Alessandro Bonvicino "Morettomasterpieces ", Tema místico, de Mariotto Albertinelli, dos grisallas anónimas (Descenso de Cristo al limbo y Resurrección y Virgen con el Niño), y San Juan Bautista, copia de Rafael por Nicolas Poussin, son sólo algunas de las notables pinturas de la escuela italiana que se encuentran en la Sala VII.

Otras obras de la escuela italiana se encuentran en la sala VIII, entre ellas Descendimiento de la escuela de Veronese, Lot embriagado por sus hijas, de Guercino, Virgen con el Niño, San Juan Niño (La Virgen de la encina), atribuida a Pordenone, y un Ecce Homo de Giovanni Battista Crespi.

En la sala IX se exponen varias obras de las escuelas italiana, flamenca y holandesa. Entre ellas se encuentran cuadros de Rubens, Daniel Seghers, Van Dyck y Jan Davidsz de Heem (Virgen con el Niño, Bodegón con granadas, peras y uvas y Bodegón con uvas, peras, peras, ciruelas y manzanas picoteadas por pájaros), así como de Daniel Seghers y Daniel Seghers (La cena de Emaús, boceto del cuadro actualmente conservado en el Prado).

El Martirio de San Mauricio y la Legión Tebana de El Greco, El Calvario de Van der Weyden, una magnífica réplica del Descendimiento de la Cruz de Michel Coxcie (el original se expone en el Prado), y un impresionante tapiz de la serie de La Conquista de Túnez, pieza significativa del maestro bruselense Willem Pannemaker realizada a mediados del siglo XVI, son algunas de las extraordinarias obras que albergan dos grandes bóvedas

La Adoración en el nombre de Jesús (también conocida como El sueño de Felipe II), San Eugenio y San Pedro son algunas de las pinturas del artista cretense expuestas en la Sala X, también conocida como Sala de los Grecos. Un impresionante tapiz flamenco de la serie Las Esferas, del siglo XVI, se exhibe junto a dos obras de Carletto Veronese, ambas representaciones de La Adoración de los Reyes.