La capilla de San Ambrosio es la primera de las capillas adosadas al muro occidental. Es una de las más antiguas del edificio y tiene cubrición de madera con algunos escasos restos del artesonado original.

No es posible precisar el nombre de la persona que realizó la fundación de la capilla, que fue renovada por el maestrescuela Juan Ruíz de Córdoba en 1528. En 1839 fue restaurada por el también maestrescuela Pedro María Villavicencio. La persistencia en la dignidad catedralicia de maestrescuelas relacionada con esta capilla se debe a que el recinto y la advocación a San Ambrosio estaban ligados al patronazgo de la maestrescolía.

El retablo, cuya realización fue concertada con los hermanos Sánchez de Rueda en el año 1717, consta de banco, cuerpo y ático de medio punto, y el banco, por mediación de cuatro basamentos sirve de apoyo a los soportes del cuerpo principal. Está articulado a partir de columnas salomónicas, y se adorna con pinturas de la Ascensión y la Epifanía, de escasa calidad, ejecutadas por Pedro Ruiz Morián, y habiendo sido concertada su realización en 1723. La calle central del retablo, cuya anchura es el doble de las calles laterales, está ocupada por una imagen de San Ambrosio del siglo XVII. En el ático del retablo está situado un Calvario de talla correspondiente a finales del siglo XVI.